Біотехнології рослин є досить новою галуззю, основою якої стали знання молекулярної та клітинної біології, фізіології та селекції рослин, цитології, мікробіології, генетики. Впровадження біотехнологічних методів та методик у традиційні технології рослинництва сприяло розвитку другої та формуванню нової селекції рослин.
Біотехнологія рослин – це наука про використання рослинних організмів, клітин, тканин та органів рослин, субклітинних, молекулярних структур та метаболітів рослинної клітини для створення біотехнологічних продуктів.
Технологічні напрямки біотехнології рослин
У сучасній біотехнології рослин виділяють три технологічні напрямки:
1. технології, що ґрунтуються на використанні культури клітин, тканин та органів рослин. Використовуються для одержання з біомаси культивованих in vitro клітин біологічно активних речовин для застосування у медичній, харчовій, косметичній промисловості тощо. Клітинні технології використовують також для отримання віддалених гібридів, створення гомозиготних диплоїдів (подвоєних гаплоїдів), розмноження та оздоровлення цінних генотипів;
2. ДНК-технології – молекулярно-генетичні методи аналізу рослин, пов’язані з аналізом молекулярно-генетичного поліморфізму рослин, детекцією патогенів, добором рослин з потрібними для селекціонера генами;
3. отримання трансгенних рослин методами генної інженерії, які дають змогу виділяти ділянки ДНК, які містять потрібні гени і вводити їх у геном рослин. Сьогодні у рослини вводяться гени стійкості проти гербіцидів і шкідників, а також гени, що контролюють білки тварин, людини, лікарські речовини тваринного походження.
Основним методом є культивування ізольованих клітин, тканин та органів in vitro (у склі, тобто в спеціальних лабораторних скляних посудинах в закритих контрольованих умовах). Що дозволяє використовувати ізольований стан об’єктів культивування в умовах in vitro, керувати диференціацією та морфогенезом рослини, спрямовувати їх на досягнення визначених цілей, проводити генетичну трансформацію. Промислова біотехнологія рослин забезпечує випуск рослинної біомаси та метаболітів для подальшого використання у медицині і ветеринарії, фармакології, косметології, харчовій та хімічній промисловості.
Усі проблеми, завдання, які вирішують у культурі in vitro, можна поділити на три основні групи:
· збереження генетичної інформації клітин (мікроклональне розмноження рослин та депонування, культура зародків, пиляків і насіннєвих зачатків);
· зміна генетичної інформації способом мутагенезу під впливом фізичних та хімічних чинників (культура калусів, клітинних суспензій, ізольованих протопластів);
· перенесення та відновлення генетичної інформації (генно-інженерне конструювання рослин з новими ознаками, соматична гібридизація).
Найпоширенішим напрямком культури тканин in vitro, що став одним з основних методів лабораторного вирощування та культивування рослин є мікроклональне розмноження ролсин (або клональне мікророзмноження).
Базові терміни для розуміння теми
Нижче наведено частину термінології, які дозволять краще зрозуміти дану тему:
Клітинна інженерія – метод отримання нових рослин шляхом маніпуляцій з клітинами.
Генетична (генна) інженерія – метод отримання нових рослин шляхом маніпуляцій з генами.
Клональне мікророзмноження – одержання в культурі in vitro нестатевим шляхом рослин (найчастіше з апікальної меристеми), генетично ідентичних вихідній рослині.
In vitro – вирощування живого матеріалу у склі, на штучних живильних середовищах в асептичних умовах.
Диференціювання – комплекс процесів, що призводять до відмінностей між материнськими та дочірніми клітинами, стан спеціалізації клітин, що відрізняє їх від інших. Проявляється морфологічними, фізіологічними і біохімічними змінами клітин.
Дедиференціювання – перехід спеціалізованих клітин, що не діляться, до проліферації, яка призводить до втрати більшості ознак спеціалізації.
Експлант – фрагмент тканини або органу, що використовується для вирощування in vitro самостійно або для одержання первинного калусу.
Калус – тканина, що виникла внаслідок дедиференціації та неорганізованої проліферації клітин на поверхні рани.
Проліферація – новоутворення клітин і тканин розмноженням.
Примордій – зачаток органа.
Клон – культура, що виникла з однієї клітини.
Морфогенез – виникнення та розвиток спеціалізованих клітин, органів і частин організму.
Органогенез – процес виникнення de novo у масі калусних клітин, що ростуть неорганізовано, зачатків органів (коренів і пагонів).
Гемогенез – утворення (диференціація) бруньок калусними клітинами.
Ризогенез – утворення коренів.
Субкультивування (пасажування) експланта – перенесення експланта, калусу, рослини-регененранта на свіже живильне середовище.
Трансгенна рослина – рослина, що містить в своєму геномі чужорідний рекомбінантний ген (гени).
Цикл вирощування (пасаж) – період між двома субкультивуваннями.
Мікроклональне розмноження рослин
Мікроклональне розмноження – це безстатеве вегетативне розмноження рослин в культурі in vitro, при якому отримують рослини, генетично ідентичні вихідній батьківській формі, що сприяє збереженню генетично однорідного посадкового матеріалу.
Цей метод дозволяє отримувати з однієї частинки материнської рослини десятки і сотні тисяч клонів (генетично ідентичні форми), чистих від патогенів (в першу чергу вірусів) та забезпечити якісний посадковий матеріал.
Клональне мікророзмноження базується на регенераційній здатності тотипотентних клітин рослин. Тотипотентність (або тотіпотентність) – це здатність деяких клітин багатоклітинного організму відтворювати (регенерувати) повністю до повноцінного організму, так можуть, наприклад, стовбурові клітини у тварин. Оскільки геном соматичних (не статевих) клітин рослин є диплоїдним та містить всю генетичну інформацію цілого організму, то вони здатні до тотипотентності за певних умов, що й використовується в даній технології. Комплексна дія групи факторів, таких, як температурний режим, живильне середовище з наявними нутрієнтами та фітогормонами, спричиняють активацію певних генів, які зумовлюють морфогенез та регенерацію тканин/клітин.
В рослинному організмі функціональна диференціація клітин (що є важливим процесом правильної регенерації пошкоджених тканин організму) зумовлюється експресією генів під впливом сукупності регуляторних систем тканин – позиційної інформації (клітинне оточення, полярність та ін.). Тобто, в процесі клонального мікророзмноження клітини оточує спеціальне штучне живильне середовище, що змінює ці «налаштування регенерації», або можна сказати, що експресія генів відбувається не включає процес диференціації та чіткого формування морфологічних ознак клітин, а забезпечує утворення свого роду універсальної групи клітин, які здатні в подальшому визначатися за морфологічними ознаками на функціональні групи, або перетворюватися на ті, які були задані дослідниками/ лаборантами, за допомогою специфічного складу штучного середовища та фітогормонів.
Обов’язковою умовою мікроклонального розмноження рослин є збереження генетичної стабільності на всіх етапах процесу від експланта до рослини-регенеранта. Диференціація соматичних клітин призводить до втрати цієї генетичної стабільності, що може спричинити виникнення небажаних явищ, таких, як ендопліплоїдія (збільшення кількості хромосом у клітинах), ампліфікації (збільшення кількості/ копіювання) деяких генів, зміни на рівні повторів ДНК. Тому при розмноженні в культурі in vitro шляхом індукції адвентивних пагонів безпосередньо з тканини експланта не виключена можливість отримання генетично неоднорідного потомства.
Адвентивні пагони – це пагони, що утворюються не з бруньок, а з інших частин ролсини (листя, корені, деякі тканини). Часто виникають через пошкодження тканин чи інші стресові фактори. При клональному мікророзмножені такі пагони утворюються у місці зрізу (пошкоджених ділянок) експланту.
Геномна мінливість характерна для соматичних клітин при індукції процесів дедиференціації і калусогенезу. Показано також, що тривале субкультивування калуса супроводжується накопиченням генних мутацій. З гетерогенних калусних тканин регенерують рослини з широкою генетичною варіабельністю – сомаклональні варіанти, що використовуються для розширення різноманіття вихідного селекційного матеріалу. Регенерація рослин з калусів, що культивуються під дією селективних факторів (складу живильного середовища, температури та ін.) покладена в основу методу клітинної селекції.
Найбільш надійним з точки зору одержання генетично ідентичного вихідним формам потомства є метод активації вже існуючих у рослині меристем. Меристемні тканини рослин містять диплоїдний набір хромосом і підтримуються в ембріонально активному стані.
Можливі механізми підтримання генетичної стабільності апікальних меристем:
· організація їх у вигляді дискретних зон;
· висока активність систем репарації ДНК;
· негативна селекція змінених клітин.
Апікальна меристема – це верхівкова твірна тканина стебла і кореня. Апікальна меристема стебла утворює клітини первинних тканин, що диференціюються (вже в меристематичній зоні) і формують примордії листків і пазушних бруньок, стебло і метамери суцвіть. Більша частина вищих рослин має проміжний тип росту, за якого в пазухах листків знаходяться додаткові меристематичні тканини, здатні сформуватися в пагін після зняття апікального домінування.
Культура меристем – це асептичне вирощування на живильних середовищах ізольованої з апексу або пазушної бруньки пагона апікальної меристеми з одним або двома листковими примордіями.
Культура апікальних меристем використовується для:
1) одержання рослин, генетично ідентичних вихідному генотипу;
2) одержання рослин, вільних від патогенів;
3) зберігання зародкової плазми (кріозбереження).
Залежно від характеру морфогенетичних процесів у культурі тканин рослини виділяють наступні типи клонального мікророзмноження:
a) активація розвитку вже існуючих в інтактній рослині меристем (апекс стебла (верхівкова меристема), пазушні й сплячі бруньки стебла);
b) індукція виникнення бруньок або ембріонів de novo (з лат. заново, наново, або впеше):
a. виникнення організованих структур безпосередньо зі спеціалізованих тканин експланта (тканини репродуктивних органів рослини, епідермісу, субепідермальних тканин, мезофілу листка);
b. виникнення організованих структур з первинного калуса, утвореного клітинами експланта;
c. виникнення організованих структур із субкультивованої калусної тканини або клітин суспензійної культури.
Інтактна рослина – це означає рослину, що не зазнала зовнішніх пошкоджень чи втручань і зберегла свою цілісність, тобто не піддавалася механічним пошкодженням, інфекційним захворюванням, або іншим стресовим факторам, які могли б вплинути на її структуру та функціонування.
У свою чергу поняття «інтактна меристема рослин» означає, що меристематична тканина не зазнавала негативного впливу стресових факторів та є цілісною, не ушкодженою та не зараженою інфекціями до моменту її вилучення і використання.
Основні етапи мікроклонального розмноження рослин
1. підготовка експлантів і введення рослини в асептичну культуру: здійснюється шляхом стерилізації відповідних експлантів (будь-які частини рослини, але зазвичай використовують пазушні і верхівкові бруньки та насіння) і вміщення їх на штучні поживні середовища. Стерилізацію експлантів проводять різними способами з використанням різних стерилізуючих засобів та речовин, наприклад, мильний розчин, розчину гіпохлориду натрію (побутова Білизна), пероксиду водню, хлориду ртуті, антисептики, фунгіциди;
2. власне процес мікророзмноження: зазвичай на даному етапі використовують фітогормони для збільшення кількості отриманих пагонів, або для пришвидшення поділу вже наявних меристематичних клітин (всіх видів бруньок), що в результаті дає початок новим пагонам. При використання в якості вихідного матеріалу органів рослин, що не містять твірної тканини (і недиференційованих клітин), фітогормональна стимуляція необхідна для утворення потрібних меристематичних клітинних угрупувань, які в подальшому використовуватимуться для утворення пагонів, або інших маніпуляцій з клітинами;
3. вкорінення отриманих мікропагонів (етап ризогенезу): Зазвичай здійснюється або шляхом перенесення отриманих пагонів на безгормональне поживне середовище, або на середовище з додаванням невисоких концентрацій ауксинів (забезпечують специфічну активацію генів, стимулюють ріст та поділ рослинних клітин) для стимулювання диференціації клітин та утворення кореневої тканини й повноцінних коренів у пагонах рослин in vitro. Окрім ауксинів, для ризогенезу пагонів рослин можуть використовувати їх спеціальну суміш з іншими фітогормонами цитокінінами (забезпечують диференціацію клітин, їхній поділ та лінійний ріст, також виконує ряд інших функцій для утворення бруньок, росту пагонів, плейротропну (множинну) дію на судинні клітини рослин та ін.);
4. переведення асептичних рослин в умови ґрунту (етап адаптації): процес адаптації рослин до ґрунту є важливим етапом мікроклонального розмноження, оскільки вже вкорінені та розвинені пагони весь час перебували у контрольованих умовах культивування, які значно відрізняються від природних умов (вологістю повітря на рівні 95% і вище, присутністю додаткових (крім вуглекислого газу) джерел Карбону та відсутністю мікрофлори), тому швидке перенесення вкорінених пагонів у польові умови, у відкритий ґрунт, просто спричинить загибель, зараження або значні ушкодження саджанців та втрату цінного садивного матеріалу. Тому зазвичай адаптацію проводять, пересаджуючи отримані молоді рослини в стерилізований ґрунт (наприклад, суміш верхового торфу з антибіотиками та фунгіцидами, а потім без них), котрий заселяється мікрофлорою поступово, даючи змогу рослинам звикнути до такого сусідства, а також повільно зменшуючи вологість повітря (спершу саджанці знаходяться кілька тижнів у спеціальній кліматичній кімнаті, де вологість (близько 80%) і температура (18-22°C) є регульованими). Крім того, протягом адаптаційного періоду молода рослина поступово переходить на повністю автотрофний спосіб живлення, оскільки в умовах асептичної культури, завдяки присутності в живильному середовищі органічних джерел Карбону (живильне середовище також містить біодоступні мікроелементи та вітаміни), вона як мінімум частково живиться гетеротрофною.
Не існує технології мікроклонального розмноження, єдиної для всіх видів рослин, тому для кожного виду (а часто – і сорту) оптимальні умови кожного з етапів підбираються індивідуально. При розробці протоколу розмноження слід враховувати генотип донорської рослини, її фізіологічний стан, розмір і тип експланта, склад поживного середовища і низку інших чинників.
На сьогодні технологія мікроклонального розмноження відпрацьована для багатьох сотень видів рослин, їх кількість постійно збільшується.
Переваги мікроклонального розмноження рослин
Перевагами цієї біотехнології порівняно з традиційними методами, що дозволили досягти їй високого ступеня комерціалізації у світі, є:
1) швидкість та високі коефіцієнти розмноження (до 100000-1000000 мериклонів за рік вже адаптованих до відкритого ґрунту): шляхом традиційного розмноження отримують в середньому 5-10 рослин, а шляхом мікроклонального розмноження можна отримати кілька мільйонів клонів ролсини;
2) скорочення площ у закритому ґрунті, зайнятих під маточними і розмножуваними рослинами;
3) можливість цілорічної роботи в лабораторних умовах і планування випуску рослин у необхідні терміни;
4) для розмноження асептичної культури необхідна невелика кількість вихідного рослинного матеріалу;
5) можливість одержувати вегетативне потомство видів рослин, що важко розмножуються в звичайних умовах;
6) можливість розмножити рідкісні та цінні рослини, використовуючи мінімальну кількість матеріалу (тканин чи насіння рослини);
7) отримання генетично ідентичного посадкового матеріалу зі збереженням всіх селекційних характеристик;
8) можливість одержувати посадковий матеріал, оздоровлений від патогенів;
9) можливість депонування (організованого зберігання) рослин за низьких позитивних температурах або кріозбереження.
Недоліки мікроклонального розмноження рослин
З недоліків методу мікроклонального розмноження рослин порівняно з традиційним методом їхнього розмноження можна назвати наступні:
1) обов’язкова наявність правильно устаткованої лабораторії для проведення відповідних робіт у спеціалізованих кімнатах;
2) витрати на забезпечення асептичних умови в процесі отримання культури тканин та розмноження експлантів;
3) регулярне приготування потрібного штучного середовища для тканинних культур та експлантів;
4) забезпечення відповідних умов культивування експлантів та усунення інфікованих екземплярів у спеціальній культуральній кімнаті.
Хоч я і назвав кілька потенційних недоліків даного методу, порівняно з традиційним способом культивування рослин, але ці недоліки легко покриваються кількістю позитивних та ефективних якостей біотехнологічного методу, а економічні витрати на створення лабораторії та забезпечення відповідних умов для роботи й культивування рослин окупаються в найближчі кілька років.
Отже, біотехнологічний метод мікроклонального розмноження рослин є ефективнішим та вигіднішим у порівнянні з традиційним способом культивування рослин.
Вельми вдячний Вам за прочитання цього довгочиту! Сподіваюся, було цікаво. Наступна публікація буде про технологію виробництва чаю, а саме про її біотехнологічні аспекти.
